mIRage-LS

O-PTIR mikroskop s vysokým rozlišením pro biologické aplikace

Vlastnosti mIRage-LS:

• Druhá generace  O-PTIR mikroskopu určená především pro biologické aplikace
• IR mikroskopie s vysokým rozlišením < 500nm měřená v řádu sekund to umožňuje 
• Zobrazení buněk ve vodním prostředí (fluorescence, IR a Raman)
• Fluorescenční a sub-mikronová IR a  Ramanova mikroskopie z jednoho místa
• Laterální rozlišení <500nm pro IR a Ramana (simultánní  měření IR a Ramanova spektroskopie)
• Možnost měření v transimisním (bottom up IR Illumination ) nebo reflexním  (top down IR illumination) uspořádání=velká flexibilita při přípravě vzorků  - vzorky na mikroskopickém skle, histologické řezy, měření v kapalině atd.
• Nekontaktní reflexní IR měření (není potřeba ATR krystal) poskytující spektra srovnatelná s FTIR transmisními spektry
• Žádné IR spektrální artefakty jako Mie/difuzní rozptyl nebo spekulární reflexe

NOVINKA - Widefield O-PTIR technika  

Tato technika představuje nový vysokorychlostní režim infračerveného, chemického zobrazování se submikronovým rozlišením pro měření široké škály značených a autofluorescenčních vzorků zahrnující buněčné, bakteriální, tkáňové a další aplikace.

Widefield O-PTIR je založen na fluorescenčně detekované fototermálním infračervené spektroskopii (FL-PTIR), která kombinuje optickou fototermální infračervenou spektrokopii  (O-PTIR) a fluorescenční mikroskopii.
Hlavní výhodou widefield O-PTIR je rychlost zobrazování, metoda je až 50x rychlejší než standardní O-PTIR technika, s typickou dobou pořízení mapy pro jednu vlnovou délku v řádech sekund (<1-10 sekund) a pro hyperspektrální IR mapy v řádech minut. Přitom je zachována výhoda vysokého laterálního rozlišení < 500 nm.

Další informace najdete v informačním prospektu a na stránkách výrobce.

Aplikace

Life Science - Buňky

Co-lokalizovaná Fluorescence + IČ spektroskopie se submikronovým rozlišením

O-PTIR měření buňky ve vodě (H₂O) s objektivem namáčeným do vody

O-PTIR fixované buňky s oil immersion objektivem

Zobrazení submikronových amyloidových agregátů v neuronech

O-PTIR image, 1630/1656                                             O-PTIR spectra

Vlevo: O-PTIR obraz poměru frekvencí 1630/1656 cm^-1.Ukazuje rozložení struktur beta proteinů s odstupem 282 nm!
Vpravo: O-PTIR spektra z IR snímku (vlevo) ukazující spektra na (#1) a mimo (#2) strukturu beta proteinu. Spektrální rozdíly, jasně ukazují rozdíly v amidovém pásu I, typickém pro proteiny se strukturou beta listu, přestože tato dvě místa jsou od sebe vzdálena pouze 282 nm!

Publikováno: Oxana Klementieva et al., "Super-resolution infrared imaging of polymorphic amyloid aggregates directly in neurons", Adv Sci, Adv. Sci. 2020, 1903004 https://doi.org/10.1002/advs.201903004

Cílený zobrazovací mód (chemicky specifické zobrazování) intrabuněčné zobrazování, mimo krycí sklíčko, po 100 nm krocích.

Poměr lipidů k proteinům                        Zobrazení délky lipidového řetězce
2856 (CH₂)/1658 (protein)                      2856 (CH₂)/2874 (CH₃)

Vlevo nahoře: Obrázek délky lipidového řetězce (2856cm^-1 (CH2)/ 2874cm^-1 (CH3). Vpravo nahoře: Obraz lipidů v poměru k bílkovinám (2856cm^-1) (CH2)/ 1658cm^-1). Oba infračervené snímky pořízené při velikosti pixelu 100 nm. ~5 minut na snímek. Vpravo dole: O-PTIR spektra ze značek na snímcích (spektra jsou jednotlivá skenování, doba měření ~1sec, bez zpracování. Vlevo dole: Optický snímek.
Data shromážděná pomocí nového "dual range (C-H/FP)". QCL, s pokrytím spektrálního rozsahu 3000-2700, 1800-950cm^-1.
Vzorek s laskavým svolením Prof. Jose Sule-Suso, Keele University, UK.
Publikace se připravuje (prosinec 2020)

Life science: Tkáň

Použití fluorescence pro lokalizaci O-PTIR měření

IR polarizované O-PTIR pro studium orientace kolagenu v jednotlivých fibrilách a šlachách

A: Spektra získaná pomocí O-PTIR z kontrolních šlachových fibril na okénku CaF₂. B: Snímek jedné frekvence vpravo zaznamenaný při 1655 cm^-1 v kolmé orientaci. Značky označují místa, v nichž byla spektra získána. Měřítko = 1 µm
C a D: Optická fototermální IČ spektra (O-PTIR) z intaktní šlachy, z měřených míst ~500 nm. (B) Jednotlivá spektra získaná ze dvou orientací řezu upevněného na okénku CaF₂ vzhledem k lineárně polarizovanému QCL. Vložený vizuální obrázek ukazuje 6 míst, která všechna leží v oblasti zobrazené pomocí FTIR FPA; měřítko = 70 μm.
Barevné značky (+) odpovídají spektrálním barvám. (C) Srovnání spekter získaných z CaF^₂ (nahoře) a skleněných (dole) substrátů v paralelní a kolmé orientaci k lineárně polarizovanému QCL.
Publikováno: Gorker Bakir et al., “Orientation Matters: Polarization Dependent IR Spectroscopy of Collagen from Intact Tendon Down to the Single Fibril Level”, Molecules 2020, 25, 4295 https://www.mdpi.com/1420-3049/25/18/4295

Kalcifikace prsní tkáně - Demonstrace <1 mikronového laterálního rozlišení O-PTIR

A: Optický snímek (mozaika). Červený rámeček označuje oblast měření IR snímku. B: Snímek jedné frekvence při 1050cm^-1 pro zvýraznění míst kalcifikace. C: O-PTIR spektra z barevných kruhových značek v IR snímku (B).
Plocha IR snímku 200 × 200 mikronů při velikosti kroku 500 nm. Doba snímání ~10 minut.
IR snímek kalcifikací při 1050cm^-1, jasně rozlišuje kalcifikace o průměrné velikosti jen několika mikronů, mnohé dokonce <1 mikron. Při 1050cm^-1 má tradiční FTIR prostorový rozměr ~12 mikronů, což je mnohem větší než skutečné rysy, a proto takto malé a lokalizované kalcifikace nebyly dříve vidět.
Vzorek byl získán s laskavým svolením profesora Nicka Stonea, Exeter University, Velká Británie. Publikace v přípravě (prosinec 2020)

Life science: Bakterie

O-PTIR mikroskopie jedné bakteriální buňky s deuteriem označenou E. coli

A: O-PTIR obraz při 1655cm^-1 (protein) při velikosti kroku 200nm. B: O-PTIR obraz při 2195cm^-1 (úsek C-D) při velikosti kroku 200nm. Pořízení obou snímků trvalo 3 minuty. C: Jednotlivá buňka E. Coli (2,6 × 1,3 mikrometru) zobrazená při 1655cm^-1 s krokem 50nm. Doba snímání ~1 min. D: Ze snímku jedné bakteriální buňky výše (vpravo nahoře) byla získána čtyři submikronová (bod ~500 nm) spektra O-PTIR s odpovídajícími barvami. Spektra jsou normalizována na 1655cm^-1. Jsou patrné vnitrobuněčné rozdíly s polohou a tvarem pásu amidu I, které naznačují detekované vnitrobuněčné chemické (sekundární strukturní rozdíly bílkovin). Každé spektrum představuje 10 průměrných hodnot (~15 s). Můžete vidět absorbance C-D na hodnotách kolem 2195cm^-1 a 2100cm^-1.

Simultánní submikronová IR+Raman mikroskopie jedné bakteriální buňky

A: Obraz bakteriálních buněk z optického mikroskopu. Oranžový rámeček označuje oblast infračerveného snímání. B: Infračervený obraz O-PTIR při 1655cm^-1 s velikostí kroku 50 nm. Doba sběru ~1 min. C: Současná submikronová IR a Ramanova spektra shromážděná z uvedeného místa na jedné bakteriální buňce. Spektra jsou normalizována na nejintenzivnější pás spektra jsou ~20sekundové kumulace. Spektra O-PTIR jsou shromážděna pomocí QCL s dvojitým rozsahem (C-H/FP), který pokrývá 3000-2700, 1800-950cm^-1 v jedné jednotce. Spektra O-PTIR jsou surová (bez zpracování). Ramanova spektra jsou korigována na základní linii.
SNR OPTIR (~500nm spot) je ~4000:1 (RMS, přičemž se bere intenzita amidového pásu jako pík a šum základní linie v poloze amidu I měřený na slepém vzorku CaF_²) s ~20sekundovou akumulací.